ELISAテストプロセスの詳細な説明

ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）は、生物医学研究で一般的に使用される実験的な方法であり、抗体、抗原、ホルモン、ウイルスなどの検出に広く使用されています。 ELISA検査を通じて、研究者は定量的または定性的分析結果を得ることができ、臨床診断、疾患監視、および医薬品開発ではかけがえのないものになります。

elisa検出

コーティング段階 ELISA検出の最初のステップは、コーティングされたプレートでテストする一次成分を修正することです。このプロセスは主に受動的な吸着によって達成され、その効果はコーティング物質の特性に依存します。サンプルに複数の抗原が含まれている場合、非特異的結合を避けるために選択的なコーティングされたプレートを選択する必要があります。ただし、間接ELISA法で抗体を検出すると、精製抗原が使用されます。コーティングされたボードの材料は、ほとんどがポリスチレンまたはその誘導体であり、その結合特性は標的物質と検出要件によって異なります。高度にグリコシル化タンパク質、炭水化物など、吸着が困難な特定の物質については、共有結合ライゲーションを可能にする特別な処理コーティングされたプレートを使用することをお勧めします。

2。試薬がコーティングされたプレートに追加された後、結合または反応を促進するためにインキュベーションが必要です。インキュベーションの温度と時間は、検出手順と操作によって異なります。通常、サンプルは、塗布後37°Cで1時間インキュベートされます。ただし、ブロッキングなどの特定の手順は、アッセイ中のインキュベーションは通常、室温で短時間で実行されます。

3。洗浄中、リン酸緩衝生理食塩水-20（PBST）は通常、緩衝液として使用され、非結合抗原、抗体、または試薬を除去します。洗浄は、マルチチャネルピペットまたは自動プレート洗濯機を使用して手動で行うことができます。不十分な洗浄は、高いバックグラウンドシグナルにつながる可能性がありますが、過度の洗浄はサンプル信号が低くなる可能性があります。洗浄の一貫性は、プレートの結果の信頼性を確保するために重要です。

iv タンパク質がELISAプレートでコーティングされた後、通常、抗体の非特異的結合を防ぐためにブロッキングが必要です。ブロックされると、検出に関連しない混合タンパク質がプレートに追加され、非特異的結合部位を占有するためにインキュベートされます。一般的に使用されるブロッキングバッファには、スキムドライミルク、ウシ血清アルブミン（BSA）、カゼインが含まれます。さらに、Tween 20やTriton X-100などの非イオン性洗剤もブロッキング剤として使用できますが、ブロッキング効果はタンパク質ほど長く続きません。効果のないブロッキングは、バックグラウンドノイズの増加につながり、検出感度と特異性が低下する可能性があります。

5。抗体>抗体はELISA検出の重要な成分であり、適切な抗体を選択することが重要です。モノクローナル抗体とポリクローナル抗体の両方を使用することができ、それぞれにはその利点と欠点があります。モノクローナル抗体は非常に特異的ですが、ポリクローナル抗体は複数の結合点で物質を標的とすることができます。二次抗体を使用すると、ステップと検出時間が増加しますが、感度の増加につながる可能性があります。したがって、検出を最適化する場合、適切な抗体ペアを見つける必要があります。

vi。最も一般的に使用されるアッセイ方法は、可視色の変化の酵素媒介化学反応を使用することです。その後、UV-VIS分光光度測定による測定が続きます。酵素結合抗原または抗体がテストに適切に添加され、存在する場合は標的物質に結合します。適切な基質が添加されると、酵素は色の変化を引き起こし、標的物質の量に比例します。西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）は、一般的に使用されるコンジュゲートの1つであり、通常、基質3,3 '、5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）と併せて使用されます。 HRPの作用により、TMBは青から黄色に変化し、その後、硫酸溶液を添加することにより反応が終了しました。最後に、各ウェルの吸光度値は、マイクロプレートリーダーを使用して450nmバンドで測定され、ブランクの毛穴の平均、技術的繰り返しの平均、または標準計算の比率を減算するなど、検出設計に従って修正および計算されました。

ELISA検出は、さまざまな医学的研究と診断で広く使用されている複雑ですが非常に重要な実験方法です。 ELISAテストプロセスを理解し、習得することにより、科学研究者は関連データを正確かつ迅速に取得し、疾患と医薬品開発の早期診断の科学的基盤を提供することができます。

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