免疫沈降（IP）

免疫沈降を必要とするワークフロー

• タンパク質間相互作用に関する研究：鉴定和验证与相关蛋白质相互作用的蛋白质。
• 翻訳後の修正分析：富集具有特定修饰（如磷酸化或泛素化）的蛋白质。
• 機能的決定：在受控环境中研究蛋白质或蛋白质复合物的活性。

免疫沈降する最良の方法

免疫沈降（古典的な免疫沈降、古典的なIP）

特定のタンパク質は、その特性、翻訳後修飾、またはさらなる分析の研究のために複雑な混合物から分離されています。

1. 溶解バッファーを使用してタンパク質を放出する細胞を溶解します。
2. 標的タンパク質用にカスタマイズされた特定の抗体をビーズ（アガロースまたは磁気）に付着させます。
3. 細胞溶解物を抗体磁気ビーズ複合体とインキュベートして、標的タンパク質を結合します。
4. 洗浄バッファーを使用して、非特異的に結合したタンパク質を洗浄します。
5. 標的タンパク質は、溶出バッファーを使用してビーズから溶出します。
6. 遠心分離機または磁気スタンドを使用して、溶解物から抗体ビーズに結合したタンパク質を分離します。

共免疫沈降（CO-IP）

主なタンパク質とその潜在的な相互作用パートナーは、タンパク質間の相互作用を研究するために複雑な生物学的サンプルから分離されました。

1. 細胞を溶解してタンパク質を放出します。
2. ネイティブタンパク質用にカスタマイズされた特定の抗体は、ビーズに付着しています。
3. 細胞溶解物を抗体ビード複合体とインキュベートしました。
4. このステップでは、ネイティブタンパク質と相互作用するタンパク質が共感します。
5. 非極端に結合したタンパク質は洗い流されます。
6. 天然のタンパク質とその相互作用するタンパク質は溶出されます。
7. 遠心分離機または磁気スタンドを使用して、抗体ビーズに結合したタンパク質を分離します。

タンデムアフィニティ浄化（タップ）

特に低存在または一時的なタンパク質間相互作用の研究のために、タンパク質複合体の高い純度精製を達成します。

1. 対象のタンパク質を遺伝的にエンジニアリングして、デュアルラベルシステムを含めます。
2. この修飾されたタンパク質を発現する細胞は溶解しています。
3. 溶解物は、最初にタンパク質を分離するために最初のタグに結合したビーズで最初にインキュベートしました。
4. 特定のプロテアーゼを使用して、最初のタグを切断します。
5. 2番目のタグに結合したビーズを使用して、第2ラウンドの精製を実行しました。
6. このステップの後、タンパク質複合体は溶出され、非常に高い純度があります。
7. 遠心分離機を使用して、ビーズに結合したタンパク質を分離します。

なぜ免疫沈降が難しいのか：

• 特異性の質問：タンパク質のビーズまたは抗体への非特異的結合は、誤検知につながる可能性があります。
• 感度の問題：低積立タンパク質が効果的に吸着されない可能性があり、その結果、偽陰性が生じます。
• タンパク質相互作用の維持：一部のタンパク質間相互作用は一時的または弱いため、IPプロセス中にこの効果をキャプチャして維持することは困難です。

免疫沈降プロセスを自動化する方法：

• 液体処理ワークステーション：これらのワークステーションは自動的にソリューションを追加および削除し、ピペッティングの一貫性と精度を確保します。
• ビーズ分離：自動化されたプラットフォームは、ビーズ分離を処理し、動作時間を短縮し、一貫性を改善します。
• 統合システム：一部のプラットフォームは、サンプルの準備、IP、およびダウンストリーム分析（質量分析など）を1つのワークフローに統合します。

マニュアルピペッティングよりも免疫沈降自動化の利点：

• 一貫性と再現性：自動化により、ヒューマンエラーと変動性が低下します。
• スループット：自動化されたシステムは、複数のサンプルを同時に処理し、効率を向上させることができます。
• 汚染のリスクを減らす：手動操作を最小限に抑え、サンプル汚染の可能性を減らします。
• 最適化ソリューション：自動化システムには通常、最適な結果を確実にするための最適化された動作手順が付属しています。