ブラッドフォード法

ブラッドフォード法は、比色法（色の変化に依存する）タンパク質定量化法です。この方法の中心には、クーマシーブライトブルーG-250染料があります。この染料は、結合されていない状態で赤茶色で、465 nmの波長で光を吸収します。しかし、それが主にアルギニンとリジンの残基を介してタンパク質に結合すると、色素の色は青に変化し、最大吸光度は595 nmになります。この色と吸光度の変化は、タンパク質濃度に比例し、定量化に使用できます。

Bradfordメソッドを必要とするワークフロー

タンパク質精製

各精製ステップの後、精製タンパク質の濃度を決定することは、収量と純度を評価するために不可欠です。 Bradfordメソッドは、タンパク質を定量化するための高速で信頼できる方法を提供し、研究者がどのコンポーネントを組み合わせる必要があるかを判断し、浄化プロセスの効率と成功率を評価するのに役立ちます。

細胞溶解物の調製

下流の用途に溶解物を使用する前に、そのタンパク質濃度を理解することが重要です。これにより、異なるサンプルで等量のタンパク質が使用されることが保証され、一貫した匹敵と同等の結果が得られます。ブラッドフォード法は、これらの溶解物の総タンパク質含有量を決定するために一般的に使用されます。

SDS-PAGEサンプル準備

正確な結果を得るには、SDS-PAGEゲルの各ウェルには、等量のタンパク質が含まれている必要があります。これにより、各車線のストリップを比較すると、観察される違いは不均一な荷重ではなく実験的条件によるものであることが保証されます。 Bradfordメソッドを使用して、サンプルのタンパク質濃度を調整して、各ウェルでタンパク質含有量を等しくすることができます。

ブラッドフォード検出方法

標準曲線法

これは、既知の濃度の標準タンパク質、通常はウシ血清アルブミン（BSA）またはガンマグロブリンを使用したキャリブレーション曲線をマッピングするなど、最も一般的な方法です。

1. サンプルの予想されるタンパク質濃度をカバーするために、一連の標準タンパク質希釈液を準備します。
2. 各標準希釈にブラッドフォード試薬を加え、短期間（通常は5〜10分）インキュベートします。
3. 各標準の吸光度は、分光光度計を使用して595 nmの波長で測定されました。
4. 吸光度値を既知のタンパク質濃度と比較して、標準曲線を生成しました。
5. 未知のサンプルの吸光度を測定し、標準曲線に基づいてタンパク質濃度を決定します。

シングルポイントメソッド

標準曲線法に代わる簡単な代替。標準タンパク質の単一濃度を使用して、未知のサンプルのタンパク質濃度を推定します。

1. サンプルの予想範囲内で濃度の濃度で単一の標準タンパク質を準備します。
2. Bradford試薬を標準的で不明なサンプルに追加します。
3. 標準サンプルと未知のサンプルの吸光度を測定します。
4. 未知のサンプルのタンパク質濃度は、既知の標準濃度に対する吸光度の比を使用して計算されます。

マイクロプレートメソッド

この方法により、ブラッドフォード法が改善され、ハイスループット分析にマイクロプレートを使用します。これにより、複数のサンプルを同時に測定できます。

1. 標準サンプルと未知のサンプルをマイクロプレートのウェルに転送します。
2. 各ウェルにブラッドフォード試薬を追加します。
3. 栽培に必要な時間。
4. 各ウェルの吸光度は、マイクロプレートリーダーを使用して595 nmの波長で測定されました。
5. 標準曲線法がマイクロプレート形式で使用されている場合、標準の吸光度値は既知の濃度と比較してキャリブレーション曲線を生成します。この曲線は、未知のサンプルのタンパク質濃度を決定するために使用されます。

手動のピペッティングと比較した自動ブラッドフォード法の利点：

• 一貫性と再現性：自動化により、ヒューマンエラーが減少し、結果がより一貫性があります。
• 高スループット：自動化されたシステムは、複数のサンプルを同時に処理し、効率を向上させることができます。
• 汚染のリスクを減らす：自動化は、サンプル間の相互汚染の可能性を最小限に抑えます。
• データロギング：自動化システムには通常、データを記録するソフトウェアが装備されているため、結果の追跡と分析が容易になります。